"Anexo" da oficina DNA fingerprint, hehe...

Extração de DNA de mucosa bucal.

Material:
1. 1 copo descartável
2. 1 “swab”
3. 10 ml de solução de NaCl 5M
4. Tesoura
5. 2 tubos de ensaio
6. Banho-maria a 60ºC
7. Álcool Isopropílico gelado
8. Caixa de isopor com gelo
9. 1 ml de detergente neutro diluído a 25%

Procedimento:

1- Higienizar a boca fazendo bochechos com água ou se possível escovando os dentes.
2- Raspar a mucosa bucal com o “swab”, dos dois lados da boca.
3- Colocar aproximadamente 5 ml de água na boca, bochechar vigorosamente e transferir a água do bocheco para um copo descartável.
4- Mergulhar o swab usado na raspagem da mucosa no volume obtido do bochecho.
5- Transferir o volume obtido no passo 3 para um tubo e adicionar o pedaço do swab.
6- Adicionar 5ml de solução NaCl 5M. Homogenizar invertendo o tubo.
7- Adicionar 1 ml de detergente neutro diluído a 25% (1:4) e homogeneizar vagarosamente.
8- Aquecer a 60ºC por 10 min. Resfriar 5 min no gelo.
9- Transferir todo o volume para um tubo de ensaio, retirando a parte do “swab” e adicionar álcool isopropílico gelado. O DNA, insolúvel no álcool, ficará visível. Manter o novo tubo no isopor com gelo.

• Liberação de componentes celulares num tampão de lise da membrana (Tris-HCl; sais como NaCl, MgCl2 ou KCl; e EDTA), detergentes e surfactantes. As enzimas presentes no detergente desestruturam as moléculas de lipídios presentes nas membranas celulares.


• Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas. Existe uma variedade de tratamentos diferentes para a desproteinização, mas todos são obtidos através da desnaturação das proteínas e enzimas, rompendo interações intramoleculares estabilizantes da estrutura da proteína ou reduzindo a concentração efetiva da água, deixando menos moléculas de água para hidratação da proteína.


• Recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol, isopropanol ou butanol). Os álcoois desidratam a molécula de DNA que expõe as cargas negativas de seus grupos fosfatos. Assim, a precipitação alcoólica só ocorre se existem cátions suficientes para neutralizar as cargas repulsoras que foram geradas entre as cadeias polinucleotídicas. Quando o sal é adicionado à solução, os íons com carga positiva do sal são atraídos pelas cargas negativas do DNA, neutralizando a carga elétrica. Isto permite que as moléculas de DNA se juntem em vez de se repelirem. A adição do álcool frio precipita o DNA, uma vez que este é insolúvel em concentrações elevadas de sal e álcool. O DNA precipita-se na camada alcoólica enquanto as outras substâncias celulares permanecem dissolvidas na solução.